Tôn Thất Thuyết sinh ngày 29 tháng 3 năm Kỷ Hợi (12/5/1839) tại làng Phú Mộng, bên bờ sông Bạch Yến, kinh thành Huế nay là thôn Phú Mộng, phường Kim Long, TP Huế. Ông là con thứ hai của Đề đốc Tôn Thất Đính và bà Văn Thị Thu và là cháu 5 đời của Hiền vương Nguyễn Phúc Tần (1620 - 1687).
Cuộc đời Tôn Thất Thuyết gắn liền với binh nghiệp. Năm 1869, ông giữ chức Án sát tỉnh Hải Dương. Tháng 7/1870 được sang làm biện lý Bộ Hộ và sau đó giữ chức Tán tương giúp Tổng thống quân vụ đại thần Hoàng Tá Viêm "dẹp loạn" ở các tỉnh phía Bắc. Sau chiến dịch này, Tôn Thất Thuyết được phong chức "Quang lộc tự khanh" và làm Tán lý quân thứ Thái Nguyên. Tháng 12/1870, ông chỉ huy đánh dẹp nhóm Đặng Chí Hùng ở Thái Nguyên, đánh tan quân Tàu Ô ở Hải Dương (1872); đánh thắng toán giặc khách ở Quảng Yên tháng 8/1872; tháng 12/1873 ông cùng Hoàng Tá Viêm phục binh tại Cầu Giấy (Hà Nội) giết chết viên chỉ huy quân sự trong đợt thực dân Pháp tiến đánh miền Bắc lần thứ nhất là đại úy Francis Garnier.
Với những chiến công này, Tôn Thất Thuyết được vua Tự Đức cho thăng tiến nhanh. Tháng 4/1874, ông giữ chức Tuần vũ tỉnh Sơn Tây kiêm Tham tán đại thần; Hiệp đốc quân vụ Đại thần; Thượng thư Bộ Binh. Năm 1883, Tôn Thất Thuyết được cử vào Cơ mật viện. Ngày 19/7/1883, trước khi băng hà, vua Tự Đức chọn Tôn Thất Thuyết làm Đệ tam phụ chính đại thần cùng với Nguyễn Văn Tường và Trần Tiễn Thành để giúp Dục Đức kế vị ngôi vua.
Với chức Phụ chính đại thần, Tôn Thất Thuyết và Nguyễn Văn Tường đã nhiều lần làm việc phế lập. Phế Dục Đức, đưa Hiệp Hòa, Kiến Phúc và Hàm Nghi lên ngôi chỉ trong một thời gian ngắn nhằm tìm ra những thủ lĩnh tinh thần cùng chí hướng kháng thực dân Pháp. Tôn Thất Thuyết trở thành đối tượng cần thanh toán số một của người Pháp. Trong tình thế luôn bị thực dân Pháp loại bỏ, Tôn Thất Thuyết đã chủ động ra tay trước bằng cuộc tấn công quân Pháp tại Huế đêm ngày 4/7/1885, khi quan Pháp đang chiêu đãi Tòa khâm sứ Pháp, tuy nhiên cuộc đánh úp đã bị thất bại. Sau đó, ông đưa Vua Hàm Nghi ra thành Tân Sở ở Quảng Trị, giúp Vua ban dụ Cần Vương. Lời dụ nhấn mạnh "người giàu đóng góp tiền của, người mạnh khỏe đóng góp sức lực, người can đảm đóng góp cánh tay, để lấy lại đất nước trong tay quân xâm lược".
Cuộc đời Tôn Thất Thuyết gắn liền với binh nghiệp.
Mọi hoạt động chấm dứt vì bị quản thúc
Em trai ông là Tôn Thất Lệ và hai người con trai của ông là Tôn Thất Đàm và Tôn Thất Thiệp cũng theo phò Vua Hàm Nghi và trở thành những nhân vật lịch sử hàng đầu trong phong trào Cần Vương. Tháng 2/1886, Tôn Thất Thuyết giao cho hai con mình là Tôn Thất Đàm, Tôn Thất Tiệp trực tiếp bảo vệ và giúp Hàm Nghi trong mọi việc. Còn ông tìm đường sang cầu viện nhà Thanh. Nhưng cuộc cầu viện không thành, ông đành tìm các người bạn lưu vong cố gắng liên hệ với phong trào trong nước tiếp tục đánh thực dân Pháp... Đến năm 1888, được tin thuộc hạ của ông là Trương Quang Ngọc làm phản bắt vua Hàm Nghi giao nộp cho thực dân Pháp, hai con ông là Tôn Thất Đàm và Tôn Thất Tiệp tuẫn tiết, ông vô cùng phẫn nộ và thương tiếc.
Năm 1889, Tôn Thất Thuyết cử người về Hà Tĩnh và phong cho Phan Đình Phùng làm Bình Trung tướng quân lãnh đạo cuộc khởi nghĩa Hương Khê. Nghĩa quân Phan Đình Phùng đã đánh một trận lớn ở Vụ Quang và giành được thắng lợi lớn. Đây là đỉnh cao nhất trong phong trào Cần Vương chống thực dân Pháp cuối thế kỷ XIX.
Năm 1895, chiến tranh Trung - Nhật nổ ra, biên giới Việt Trung bị kiểm soát, người Pháp yêu cầu nhà Mãn Thanh quản thúc Tôn Thất Thuyết và theo dõi Lưu Vĩnh Phúc nên mọi hoạt động của ông chấm dứt. Tôn Thất Thuyết bị quản thúc, không được đi lại bất cứ đâu. Tương truyền trong những năm cuối đời, ông như điên dại, thường múa gươm chém đá. Ông mất tại Trung Quốc ngày 22/9/1913.
