Các phương pháp chuyển gen gián tiếp

Trần Thị Loan Công nghệ sinh học phân tử

K14 – Sinh học thực nghiệm PAGE 8

Các phương pháp chuyển gen gián tiếp

Khái niệm chuyển gen gián tiếp

Chuyển gen gián tiếp là quá trình gen được chuyển vào tế bào thông qua một sinh vật trung gian thường là vi khuẩn , virus hoặc retrovirus

2. Các phương pháp chuyển gen gián tiếp

2.1 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn đất Agrobacterium

2.1.1 Nguyên lý chung

Agrobacterium là nhóm vi sinh vật gram âm , gây ra các triệu chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương.

Chi Agrobacterium bao gồm một số nhóm chính sau:

A. tumefaciens gây bệnh u thân cây

A. shizogenes gây bệnh tóc rễ cây

A. rubi gây bệnh u cho các cây dâu đất, mâm xôi…

Trong các loài trên người ta thường sử dụng A. tumefaciens để chuyển gen.

Từ lâu người ta đã phát hiện sự hình thành khối u ở thân cây và thường gặp ở chỗ tiếp giáp giữa rễ và thân khi cây bị nhiễm vi sinh vật A. tumefaciens qua vết thương. Phân tích các khối u của cây cho thấy có sự hình thành một số chất mới như noparin và octopin được gọi chung là opin. Các chất opin này không tồn tại ở những cây bình thường. Điều đặc biệt là các khối u không ngừng tang trưởng kể cả khi đã tiêu diệt hết các vi khuẩn trong cây đã bị nhiễm

Phân tích A. tumefaciens cho thấy chúng có chứa các plasmid như các vi khuẩn khác. Các plasmid này cũng có khả năng tụ sao chép độc lập và chúng có kích thước lớn.

Những vi khuẩn đất không có plasmid thì không có khả năng gây khối u cho cây. Như vậy , chính plasmid đã mang gen gây khối u cho cây. Người ta gọi plasmid này là plasmid Ti ( Tumo inducing plasmid). Plasmid Ti là plasmid có kích thước lớn khoảng 200kb đã được xác định trật tự. Khi lây nhiễm vào tế bào thực vật một phần nhỏ của plasmid Ti khoảng 25kb được gọi là T- DNA được chuyển và gắn vào hẹ gen của thực vật. Nhờ vậy đoạn T- DNA tồn tại trong hệ gen của thực vật mà nó gắn vào. Trong plasmid Ti đoạn T- DNA được giới hạn bằng bờ phải (R) và bờ trái (L) có các đoạn nucleotit tương tự nhau. Đoạn T- DNA chứa các gen tổng hợp auxin, cytokinin, đó là các gen gây khối u và chứa các gen tổng hợp ra opin.

Ngoài đoạn T- DNA, trên plasmid Ti còn chứa các gen E, D, C, G, B, A tạo ra các enzim tương ứng . các enzim này có chức năng cắt đứt bớ phải và bờ trái để giải phóng T- DNA có chịu chách nhiễm lây nhiễm như có chức năng bọc T- DNA , vận chuyển và gắn T- DNA vào tế bào vật chủ. Plasmid Ti còn có điểm khởi đầu sao chép Ori và các gen đồng hóa opin. Opin là “ chất dinh dưỡng ” của vi khuẩn.

Dựa vào các đặc tính của plasmid Ti các nhà khoa học đã tạo ra vecto liên hợp và vecto nhị nguyên để chuyển gen vào cây trồng khi cần thiết.

2.1.1.1 Vecto liên hợp

Là kết quả của sự liên hợp của hai loại plasmid: plasmid Ti đã cắt bỏ gen gây khối u, các gen tổng opin nhưng vẫn giữ vùng vri bờ phải và bờ trái. Thay vào phần bị cắt bỏ là đoạn tương đồng của plasmid trung gian thứ 2 có chứa vùng gắn gen cần chuyển theo yêu cầu của con người. Khi cho hai loại plasmid này tiếp xúc với nhau chúng sẽ sảy ra trao đổi chéo giữa các đoạn tương ứng nhau. Kết quả là tạo ra vecto mới nằm trong vi khuẩn A. tumefaciens, có thể chuyển gen cần thiết vào cây theo cơ chế thông thường.

2.1.1.2 Vecto nhị thể

Khác với vecto liên hợp là chúng có cả hai loại plasmid cùng tồn tại và hoạt động trong vi khuẩn A. tumefaciens. Loại plasmid thứ nhất tách dòng từ Ecoli trong đó có thiết kế vùng bờ phải, bờ trái và ở giữa hai bờ là các gen chỉ thị và gen cần chuyển vào cây. Plasmid thư hai chính là plasmid Ti bị cắt bỏ T- DNA, bờ trái, bờ phải chỉ giữ lại vùng vri. Nhờ hệ thống vecto nhị thể này ta có thể chuyển gen một cách hữu hiệu

2.1.2 Quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium

Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium để chuyển gen đã thu được nhiều kết quả, đặc biệt là trên lúa và các cây lương thực.

Quá trình chuyển gennhờ vi khuẩn Agrobacterium diễn ra qua nhiều giai đoạn ta có thể hình dung các giai đoạn đó thông qua các ví dụ sau:

2.1.2.1 Quy trình chuyển gen vào lúa mì nhờ Agrobacterium

Năm 1997 , lần đầu tiên lúa mì được tiến hành chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium nhưng chưa được hoàn thiện , cho đến nay qua hàng loạt nghiên cứu , quy trình chuyển gen vào lúa mì hoàn thiện bao gồm các buớc sau:

- Chuẩn bị phôi từ hạt lúa mì

+ Gieo 4-5 hạt lúa mì vào mỗi khay có đường kính 20cm

+ Đưa ác khay vào nhà kính hoặc tủ nuôi có nhiệt độ khoảng 18- 20 độ C vàoban ngày và 14- 15 độ C vào ban đêm , với độ ẩm không khí khoảng 50-70% và chế độ chiếu sáng 16 giờ mỗi ngày.

+ Sau khi lúa trổ bông đuợc 12-16 ngày hát cac bông lúa về bóc 1 số hạt để xác đs trúc phịnh cấu trúc phôi nếu phôi có chiều dài từ 0,8- 1,5mm ,có màu đục là được

+ Các bông còn lại đem khử trùng trong etanol 70% trong 1 phút sau đó đem ngâm vào dung dịch thuốc tẩy trắng 10% lắc nhẹ trong 15 phút sau đó tráng sạch thước tẩy trắng ít nhất 3 lần

+ Dùng dao vô trùng tách phôi ra khỏi hạt ( thao tác dưới kính hiển vi)

+ Loại bỏ trục phôi và chỉ giữ lại phôi sau đó đưa phôi vào đĩa petri chứa môi trường bán lỏng . mối đĩa petri đường kính 55mm cho vào 50 phôi.

- Chuẩn bị Agrobacterium

Agrobacterium có mang plasmid Ti và vecto nhị thể đã mang gen cần chuyển được chuẩn bị sẵn sàng

+ Nuôi Agrobacterium trong 10ml môi trường lỏng cho thêm glycerol 2% và kháng sinh tương ứng . ủ ở tủ ấm 27- 29 độ C có lắc nhẹ 250 lần / phút trong thời gian 12 đến 14 giờ đo độ đục cho đến khi được OD 600nm > 1 là kết thúc nuôi

+ Ly tâm thu Agobacterium với tốc độ 4500 vòng/ phút trong 10 phút. Thu cặn Agrobacterium rồi hòa cặn trong 4ml môi trường nuôi cấy có chứa acetosyingone 250nM/l

+ Chuyển lại hỗn hợp này lên tủ ấm có lăc nhẹ cho đén khi sử dụng ( không quá 3 giờ)

- Nuôi cấy phôi với Agrobactrium

+ Lấy 4ml môi trường có nuôi cấy Agrobacterium ở trên bổ sung thêm silwet để đạt nồng độ cuối cùng là 0.015% sau đó đổ chỗ môi trường này vào đĩa petri chứa 50 phôi đã chuẩn bị ở trên.

- Ủ đĩa phôi ở nhiệt độ phòng khoảng từ 1-3 giờ

- Chuyển các phôi sang môi trường mới rồi đưa vào bóng tối ở nhiệt độ phòng 22- 23 độ C khoảng từ 2-3 ngày

- Sau đó chuyển phôi đến môi trường mới tạo mô sẹo rồi đêr trong bongs tối ở nhiệt độ 24-25 độ C trong 18 ngày

- sau 18 ngày mô sẹo được chuyển sang môi trường thích hợp ( môi trường RDZ) ur ở nhiệt độ 24-25 độ C dưới ánh sáng trong 3 tuần

- chuyển mô sẹo sang môitrường chọn lọc để tạo chồi sẽ hình thành cây con

- cứ sau 3 tuần lại chuyển cây sang môi trường RPPT mới cho dến khi cây non chống chịu với PPT tì chuyển cây ra trồng ở môi trường vườn ươm hoặc đât trồng

2.1.2.2 Chuyển gen vào cây lúa nước nhờ vi khuẩn Agrobacterium

Chuyển gen vào cây luá nước cũng tương tự như cây lúa mì tuy nhiên có một số công đoạn thay đổi. Cụ thể các bươc tiến hành như sau:

- Thân non hoặc lá non của lúa được khử trùng bề mặt bàng dung dịch clo trong 20 phút

- Rửa sạch bằng nước cất 5 lần

- Agrobacterium đã mang vecto nhị thể và plasmid Ti được nuôi trong môi trường LB lỏng ở nhiệt độ 25 độ C có bổng sung chất kháng sinh thích hợp

- Đo độ đục của dungdịch nuôi tới khi đạt OD 400nm = 0.4 thì tiến hành ly tâm tốc độ 2600 vòng/ phút trong 30 phút để thu cặn Agrobacterium . hòa cặn Agrobacterium vào 4ml môi trường tạo mô sẹo IM rồi ủ ở nhiệt độ phòng co lắc nhẹ 50 – 100 lần / phút trong khoảng 1 giờ

- Chuyên mô cả thân non , lá non đã chuẩn bị ở trên vào 4ml dung dịch Agrobacterium ã chuẩn bị sau dó để trên máy lắc 1- 2 giờ

- Chuyển mô vào môi trường tạo mô sẹo CIM rồi để vào bóng tối ở nhiệt độ 19- 25 độ C trong thời gian từ 2-3 ngày

- Rửa mô bằng nước cất 5 lần rồi rửa bằng nước rửa

- Chuyển mô vào môi trường tạo mô sẹo có bổ sund các chất chọn lọc như kháng sinh cefotaxin 50mg/l, kanamycin 50mg/l và nuôi trong 3-4 tuần

- Chuyển chồi sang môi trường tạo rễ với việc bổ sung 0.5mM IBA cùng với 25mg/l kanamycin thời gian tạo rễ kéo dài vài tháng thì tạo cây con

2.2 Chuyển gen nhờ virus và retrovirus

Ngoài việc sử dụng vi khuẩn người ta con sử dụng virus và retrovirus làm vecto chuyển gen

2.2.1 Khái niệm chuyển gen nhờ virus và retrovirus

- Chuyển gen nhờ virus là phương pháp đưa gen ngoại lai chèn vào hệ gen của virus sau đó cho virus nhiễm vào tế bào vật chủ

- Chuyển gen nhờ retrovirus mang gen ngoại lai : sau khi xâm nhiễm vào tế bào vật chủ retrovirus sẽ tổng hợp ra cDNA nhờ enzim phiên mã ngược . cDNA mạch kép của gen ngoại lai sẽ được chèn vào hệ gen của tế bào vật chủ

- Chuyển gen nhờ virus có nhiều thuận lợi vì virus dễ xâm nhập và lây lan trong cơ thể vật chủ đồng thời virus có thể mang đoạn DNA lớn hơn so với plasmid. Tuy nhiên virus làm vecto chuyển gen cần có những tiêu chuẩn sau:

+ Hệ gen của virus phải là DNA

+ Virus có khả năng xâm nhập , di chuyển từ tế bào này sâng tế bào khác qua các lỗ vách tế bào

+ có khả năng kí sinh tren nhiều loại vật chủ

2.2.2 Các bước tiến hành

Có nhiều loại virus và retrovirus dùng làm vecto chuyển gen. sau đây chúng ta đi xét trường hợp chuyển gen nhờ retrovirus

- Retrovirus có hệ gen là RNA có thể chuyển thành DNA mạch kép bằng enzim phiên mã ngược của retrovirus. Sau khi xâm nhiễm vào tế bào vật chủ thì RNA chứa gen ngoại lai của retrovirus hình thành DNA kép và DNA kép này sẽ gắn với hệ gen của tế bào vật chủ. DNA của retrovirus sau khi gắn vào tế bào vật chủ có thể truyền lại cho các thế hệ tế bào vật chủ thế hệ sau

- Cách chuyển gen thường sử dụng tế bào mầm dược nuôi cấy cho lây nhễm với retrovirus manggen ngoai lai trước khi tế bào mầm biệt hóa thành tinh trùng là c ó hiệu quả. Tinh trùng sau khi chuyển gen ngoại lai từ retrovirus sẽ thụ tinh nhân tạo . cngx có thể chuyển gen vào tế bào phôi rồi đưa vào cơ thể mẹ vì thế muốn chuyển gen dung retrovirus làm vecto thì trước tiên chúng ta phải loại bỏ gen gây ung thư của nó đồng thời phải loại bỏ 1 phần hệ gen của retrovirus để tạo khoảng trống làm nơi gắn gen ngoại lai

2.2.3 Ứng dụng

Chuyển gen nhờ virus và retrovirus được ứng dụng nhiều đối với cá mú vằn (Danio rerio) hoặc cá medaka và vào chuột…

Chuyển gen nhờ virus và retrovirus cũng có thể được ứng dụng để chữa một số khuyết tật di truyền ví dụ như phục hồi việc sản xuất insulin ở người macws bệnh đáo tháo đường. Tuy nhiên cần thận trọng trong việc sử dụng virus và retrovirus để chuyển gen. các virus và retrovirus phải đảm bảo an toàn và phải biết tường tận về chúng trước khi sử dụng chúng là vecto chuyển gen

2.3 Chuyển gen bằng sử dụng liposom sử lý tinh trùng

2.3.1 Khái niệm

Chuyển gen bằng sử dụng liposom là kĩ thuật ủ tinh trùng với liposom chứa plasmid tái tổ hợp mang gen ngoại lai sau đó dùng tinh trùng này cho thụ tinh nhân tạo. Từ đó sẽ tạo ra phôi mang gen ngoại lai. Bình thường tinh trùng không dung hợp với các đoạn DNA trần nhưng khi sử dụng liposom lá các mang lipit gói bọc DNA ngoại lai thì có thể đưa chúng vào bên trong tinh trùng. Tinh trùng mang gen ngoại lai được thụ tinh với trúng tạo ra hợp tử chuyển gen

2.3.2 Cách bước tiến hành

- Phương pháp

Plasmid tái tổ hợp mang gen ngoail lai được đóng gói trong liposom rồi được phủ một lớp tinh trùng mỏng với khoảng 10^7 tinh trùng ở 37 độ C trong thời gian 30 phút sau đó lấy tinh trùng ra cho thụ tinh nhân tạo. Thế hệ con F1 được kiểm tra gen chuyển và biểu hiện của gen chuyển. Kiểm tra gen chuyển có dung hợp không bằng phương pháp PCR hoặc bằng phương pháp lai southern blot . sử biểu hiện của gen chuyển còn được xác định bằng phương pháp điện di máu trên gel polyacrylamid. Nếu gen chuyển thành công thì băng điện di protein sẽ xuất hiện băng protein tương ứng với gen chuyển mã hóa

- Ưu điểm

Phương pháp chuyển gen bằng thụ tinh nhân tạo dễ thực hiện . việc sử lý tinh trùng với liposom chứa DNA ngoại lại không ảnh hưởng tới khả năng sinh sản cũng như sức sống của thế hệ con. Phương pháp này phù hợp với việc tạo ra một số lượng lớn con cháu chuyển gen.