Căn cứ theo giả thuyết do Thiên Nam ngữ lục nêu mà sử gia Đào Duy Anh đồng tình, cuộc nổi dậy chống nhà Đông Hán đã diễn ra vào nửa cuối năm 39 và bị Tô Định trấn áp khiến Thi Sách bị hại. Sau khi Thi Sách bị Tô Định giết, Trưng Trắc và các Lạc tướng càng căm thù, quyết tâm chống lại nhà Hán để trả thù. Bà cùng Trưng Nhị mang quân bản bộ về giữ Hát Môn[15].

Tháng 9 năm 39, Trưng Trắc và Trưng Nhị tập hợp các tướng lĩnh cùng nhau làm Hội thề ở cửa sông Hát (huyện Phúc Thọ, Hà Nội) thuộc huyện Mê Linh thời đó. Thiên Nam ngữ lục ghi lời thề của Trưng Trắc như sau[16][17]:

"Một xin rửa sạch nước thù

Hai xin dựng lại nghiệp xưa họ Hùng

Ba kêu oan ức lòng chồng

Bốn xin vẻn vẹn sở công lênh này"

Sau một thời gian chuẩn bị, tháng 2 năm 40, Trưng Trắc cùng Trưng Nhị chính thức phát động khởi nghĩa chống lại nhà Đông Hán. Sách Đại Việt sử ký tiền biên của Ngô Thì Sĩ ghi lại lời chép trong dã sử cho biết, khi Trưng Trắc xuất quân vẫn chưa hết tang chồng, bà trang điểm rất đẹp. Các tướng hỏi vì sao, bà đáp rằng:

Việc binh không thể ảnh hưởng. Nếu giữ lễ và làm xấu dung nhan thì nhuệ khí tự nhiên suy kém. Cho nên ta mặc đẹp để mạnh thêm nhiều màu sắc của quân, khiến cho bọn giặc trông thấy động lòng, lợi là chí tranh đấu, thì dễ giành phần thắng.

Mọi người nghe đều thán phục là không bằng bà[18].

Cuộc khởi nghĩa được sự hưởng ứng của nhiều đội quân và nhân dân các nơi thuộc Âu Lạc và Nam Việt cũ[19][20]. Quân Hai Bà đánh hãm trị sở Luy Lâu. Sử sách ghi lại rất sơ lược diễn biến cuộc khởi nghĩa của Hai Bà từ khi bắt đầu tới khi thắng lợi. Sách Hậu Hán thư chép:

Năm Kiến Vũ thứ 16 (40), người con gái ở Giao Chỉ là Trưng Trắc và em gái là Trưng Nhị làm phản, đánh phá quận. Trưng Trắc là con gái Lạc tướng huyện Mê Linh, là vợ Thi Sách người Chu Diên, rất hùng dũng. Thái thú Giao Chỉ là Tô Định dùng pháp luật trói buộc, Trưng Trắc phẫn nộ, vì thế mà làm phản. Do vậy, những người Man, người Lý ở Cửu Chân, Nhật Nam, Hợp Phố đều hưởng ứng. Gồm chiếm được 65 thành tự lập làm vua. Thứ sử Giao Chỉ và các thái thú chỉ giữ được thân mình mà thôi”

Sách Thủy kinh chú chép[21]:

[Hai Bà] công phá châu châu huyện, hàng phục được các Lạc tướng, họ đều suy tôn Trưng Trắc làm vua

Các sử gia căn cứ theo các thần phả và truyền thuyết tóm lược trình tự cuộc khởi nghĩa như sau[21][22][23]:

Quân Hai Bà trước tiên tấn công đô úy trị quận Giao Chỉ ở Mê Linh. Chiếm được nơi đây, Hai Bà Trưng tiến đánh huyện Tây Vu, chiếm thành Cổ Loa

Trên đà thắng lợi, từ Cổ Loa, Hai Bà Trưng mang quân vượt sông Hoàng, sông Đuống đánh trị sở Giao Chỉ ở Luy Lâu bên bờ sông Dâu (lãng Lũng Khê, Thuận Thành, Bắc Ninh). Quân khởi nghĩa tấn công quá nhanh khiến Tô Định không kịp trở tay. Trước thế mạnh của quân Hai Bà, các viên quan cầm đầu không trở tay kịp và không dám chống cự, bỏ chạy về phương Bắc.

Thái thú Giao Chỉ là Tô Định hoảng hốt cũng tháo chạy. Để thoát thân, Tô Định phải cạo tóc, cạo râu, trà trộn vào loạn quân, vứt bỏ ấn tín mà chạy. Tương truyền người Việt đương thời vẫn có tục lệ phổ biến là cạo tóc, nên Tô Định làm như vậy để bắt chước cho khỏi bị phát hiện trên đường trốn[24]. Cuối cùng Tô Định thoát về quận Nam Hải, bị Mã Viện dâng sớ lên Hán Quang Vũ Đế hạch tội “thấy tiền thì giương mắt lên, thấy giặc thì cụp mắt xuống”. Vua Hán hạ ngục trị tội Tô Định.

Cuộc khởi nghĩa Hai Bà Trưng được nhân dân khắp nơi hưởng ứng rất nhiều. Sau khi Luy Lâu bị hạ, các thành khác nhanh chóng tan vỡ và quy phục. Cuộc khởi nghĩa lan rộng vào Cửu Chân, Nhật Nam, sang Uất Lâm, Hợp Phố…

Khởi nghĩa thắng lợi, Trưng Trắc lên ngôi vua, xưng vương. Thần phả cho biết Trưng Nhị được phong làm Phó Vương[25].

Các nguồn sử liệu đều thống nhất rằng phạm vi cuộc khởi nghĩa không gói trong phạm vi quận Giao Chỉ mà là toàn bộ Giao Chỉ Bộ đương thời, tức là trong khoảng toàn bộ lãnh thổ nước Nam Việt cũ. Có ý kiến lý giải đó là lý do vì sao lãnh thổ thời Hai Bà Trưng được gọi là Lĩnh Nam (“Lĩnh Nam riêng một triều đình nước ta”)[26].

Các bộ sử cũ như Đại Việt sử lược, Đại Việt sử ký toàn thư, Khâm định Việt sử thông giám cương mục đều ghi Hai Bà Trưng chiếm được 65 thành. Riêng Ngô Thì Sĩ soạn Đại Việt sử ký tiền biên đã kê lại từng thành (huyện) trong mỗi quận và cho ra tổng số các thành thuộc 7 quận đất Âu Lạc và Nam Việt cũ (Giao Chỉ, Cửu Chân, Nhật Nam, Hợp Phố, Thương Ngô, Uất Lâm, Nam Hải) chỉ là 56[18].

Tuy nhiên, lại có ý kiến cho rằng phạm vi cuộc khởi nghĩa rộng hơn như vậy, không chỉ bao gồm trong phạm vi Giao Chỉ Bộ mà lan sang cả một số địa phương phía nam Dương châu và Kinh châu, do đó tổng số huyện thành mà sử cũ ghi 65 là chính xác[27].

Các sử gia hiện đại xem xét phạm vi cuộc khởi nghĩa dè dặt hơn và cũng không thống nhất. Trần Trọng Kim và Đào Duy Anh, tuy cùng ghi nhận số 65 thành nhưng cho rằng phạm vi cuộc khởi nghĩa chỉ bao gồm các quận: Giao Chỉ, Cửu Chân, Nhật Nam và Hợp Phố[15][28]. Các sách Lịch sử Việt Nam do các nhóm tác giả khác nhau cũng ghi nhận phạm vi khác nhau: có nguồn chỉ ghi nhận phạm vi khởi nghĩa trong 2 quận Giao Chỉ và Cửu Chân[23], nguồn khác lại khẳng định phạm vi trên 7 quận Giai Chỉ Bộ, tức là toàn lãnh thổ Âu Lạc và Nam Việt cũ[9].