Mạng lưới nội chất đảm nhiệm nhiều vai trò trọng yếu trong mỗi tế bào; và như đã đề cập chức năng, cấu trúc của mạng lưới này cũng thay đổi tùy theo từng loại tế bào.[3][4]
Sinh tổng hợp protein và lipid: Hệ thống mạng lưới nội chất tỏa rộng khắp tế bào đóng vai trò trung tâm trong việc sinh tổng hợp các protein và lipid cần thiết. Thật vậy, phần lớn các loại protein, lớp màng kép lipid cùng những loại lipid của phần lớn các bào quan - bao gồm cả bộ máy Golgi, tiêu thể, nội thể, túi tiết và ngay bản thân mạng lưới nội chất - đều được sản sinh từ lớp màng của hệ thống mạng lưới này.[3][5][6]
Glycosyl hóa và cuộn gập các protein: Phần lớn các protein trước khi được chuyển đến đích cần phải trải qua quá trình glycosyl hóa để trở thành các glycoprotein, đồng thời các protein phải được cuộn xoắn và hình thành các liên kết disulfit đúng quy cách. Các enzyme nằm trên bề mặt trong của mạng lưới nội chất sẽ đảm nhiệm việc thực thi và kiểm tra các quá trình này. Mạng lưới nội chất cũng chứa các enzyme và protein có chức năng tống khứ các "sản phẩm" sai hỏng vào tế bảo chất để các tiêu thể xử lý; nếu số lượng protein sai hỏng tăng lên quá nhiều thì các thụ thể trong mạng lưới nội chất sẽ truyền tín hiệu về nhân tế bào để tế bào có phản ứng đối phó thích hợp.[7][8][9]
Chuyển vận các chất: mạng lưới nội chất là nơi đảm nhiệm quá trình trung chuyển các chất (nhất là protein) trong tế bào. Các loại protein cần thiết cho việc bài tiết và cho các bào quan đều được chuyển từ tế bào chất tới mạng lưới này để được trung chuyển tới đích. Như đã nói, vào cuối quá trình sinh tổng hợp protein tại ribosome, protein sẽ được chuyển vận vào lưới nội chất thông qua quá trình chuyển dịch đồng dịch mã (co-translational translocation) và các phân tử protein, lipid đã được sinh tổng hợp sẽ được chuyển từ mạng lưới nội chất sangbộ máy Golgi tại các đoạn mạng lưới nội chất chuyển tiếp (transitional ER).[3][4]
Vai trò trong bài tiết protein: Một số protein nằm trong lớp màng của mạng lưới nội chất sẽ bị cắt bỏ phần nằm trong màng, phần còn lại sẽ được gắn vào một "cái neo" axít béo mang tên neo glycosylphospatidyl-inositol(neo GPI) cũng được gắn vào trong màng lưới nội chất. Phần màng này sẽ tách khỏi lưới nội chất và hình thành một túi mang protein đến một vị trí nhất định trong tế bào (thường là tại màng tế bào hay màng của một bào quan) nhằm phản ứng với một kích thích mà tế bào nhận được. Phần neo GPI có vai trò quan trọng trong việc định hướng cho túi protein tới vị trí đích đến.[10]
Dự trữ ion Ca2+: Mạng lưới nội chất là nơi dự trữ các ion Ca2+ dùng trong nhiều phản ứng đáp ứng quan trọng của tế bào trước các tín hiệu mà nó nhận được. Một bơm ion canxi đặc biệt sẽ có nhiệm vụ đưa Ca2+ từ lưới nội chất vào tế bào chất. Nhằm lấp đầy các ion Ca2+ hao hụt trong các phản ứng này, một bơm Ca2+ đảm nhiệm vai trò đưa ion canxi ngược từ tế bào chất vào mạng lưới nội chất. Một số đoạn trong hệ thống lưới nội chất được thiết kế để chuyên đảm nhiệm vai trò dự trữ các ion Ca2+, tỉ như các lưới cơ tương trong các tế bào cơ.